島津中國創(chuàng)新中心與張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心合作，通過在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀Nexera UC（Online SFE-SFC-MS/MS），開發(fā)水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物隱性孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫的測定方法，為Nexera UC在水產(chǎn)品自動(dòng)化分析的應(yīng)用提供了參考。
01背景介紹
孔雀石綠（Malachite Green，MG）和結(jié)晶紫（Gentian violet，GV）均為人工合成的有機(jī)化合物,屬于三苯甲烷型染料，同時(shí)也是殺菌和殺寄生蟲的化學(xué)制劑，常用于魚類水霉病等寄生蟲病的防治，或作為消毒劑用于鮮活魚類運(yùn)輸過程中，以延長魚類的存活時(shí)間�？兹甘G和結(jié)晶紫在生物體內(nèi)分別代謝為隱性孔雀石綠和隱性結(jié)晶紫。這些化合物具有高殘留、高毒性、高致畸和高致癌性，對人們的健康構(gòu)成了潛在的巨大威脅，我國自2005年已將其列入禁用目錄中。
島津分析儀器目前國標(biāo)中檢測方法主要有高效液相色譜法、熒光色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，但前處理方法繁瑣。本方法采用在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Online SFE-SFC-MS/MS），對水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的殘留量進(jìn)行測定，樣品只需簡單粉碎后加入脫水劑即可直接上機(jī)，進(jìn)行超臨界流體萃取、經(jīng)超臨界流體色譜分離和質(zhì)譜檢測。與傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法相比較，Online SFE-SFC-MS/MS法將以往樣品前處理以及分析檢測的數(shù)小時(shí)，縮短到現(xiàn)在全流程僅需要30分鐘，該方法具有簡單、快速、安全、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀Nexera UC
02實(shí)驗(yàn)方法
（1）萃取條件：
萃取劑：A為超臨界CO2，B為含0.1%甲酸的甲醇。萃取劑比例：（95：5，V/V）。萃取流速：3 mL/ min。萃取溫度：40℃。萃取時(shí)背壓A為15 MPa，背壓B為14.8 MPa。采取先靜態(tài)萃取4 min，再動(dòng)態(tài)萃取3 min的方式進(jìn)行萃取。
（2）色譜條件：
色譜柱：Shim-pack UC-X RP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)。
流動(dòng)相：A為超臨界CO2，B為含0.1%甲酸的甲醇。流速：2 mL/ min。柱溫：40℃。采用5%B (7 min)- 30%B(10-15 min)- 5%B(15.1-17 min)梯度洗脫程序。洗脫時(shí)背壓A為15 MPa，背壓B為40 MPa。
（3）質(zhì)譜條件：
正離子檢測模式；離子源：ESI源。離子源溫度：400 ℃。脫溶劑管溫度：200 ℃。加熱模塊溫度：400 ℃。霧化氣流量：3 L/min。加熱氣流量：15 L/min。干燥氣流量：5 L/min。
03結(jié)果與討論
（1）線性和定量限
配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（10ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、60ng/mL、100 ng/mL、160 ng/mL、200 ng/mL），以超臨界流體萃取專用空白濾紙片為基質(zhì)，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加在濾紙上，并放入5mL規(guī)格超臨界流體萃取裝置的萃取罐中，按照本試驗(yàn)選取的超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表1。結(jié)果顯示該方法在試驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
以空白蝦肉樣品為基質(zhì)，稱取1.0g，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)混合溶液加入空白基質(zhì)，混勻后，進(jìn)行測定，記錄峰面積，在信噪比S/N約為10時(shí)測得最低檢測濃度為0.5μg/kg，即定量限為0.5μg/kg。
（2）回收率與精密度
分別以空白蝦肉和空白魚肉基質(zhì)，各稱取1.0g，加入不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)混合液，按照本試驗(yàn)選取的超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測條件提取測定，將峰面積代入回歸方程計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果在0.5ng/g～5ng/g的加標(biāo)范圍內(nèi)，水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱形孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫的回收率范圍分別為80.28%～108.21%、89.02%～110.46%、80.19%～110.36%、85.22%～109.38%，RSD值范圍分別為5.3%～7.1%、4.9%～7.9%、5.2%～8.9%、5.7%～6.6%。
04結(jié)論
通過使用在線超臨界流體萃取-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，可實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的殘留量的快速自動(dòng)化檢測，該方法不僅簡化了樣品前處理操作，節(jié)省了分析時(shí)間，而且也是一種綠色環(huán)保的檢測技術(shù)。
